Avaliação do “tempo de prateleira” de membranas de nitrocelulose imobilizadas com antígeno de Paracoccidioides brasiliensis para o imunodiagnóstico da paracoccidioidomicose

Luciane Regina Franciscone Silva; Camila Mika Kamikawa; Angela Noronha Passos; Valdelene Sayuri Kohara; Adriana Pardini Vicentini

doi:10.18241/.v76i0.33536

Luciane Regina Franciscone Silva Instituto Adolfo Lutz, Centro de Imunologia, São Paulo, SP
Camila Mika Kamikawa Instituto Adolfo Lutz, Centro de Imunologia, São Paulo, SP
Angela Noronha Passos Instituto Adolfo Lutz, Centro de Imunologia, São Paulo, SP
Valdelene Sayuri Kohara Instituto Adolfo Lutz, Centro de Imunologia, São Paulo, SP
Adriana Pardini Vicentini Instituto Adolfo Lutz, Centro de Imunologia, São Paulo, SP

DOI: https://doi.org/10.18241/.v76i0.33536

Palavras-chave: Paracoccidioides brasiliensis, paracoccidioidomicose, immunoblotting, testes sorológicos

Resumo

Considerando-se que o immunoblotting para o imunodiagnóstico da paracoccidioidomicose (PCM) é uma metodologia in house e laboriosa envolvendo duas etapas iniciais, SDS-PAGE e Western blot, neste estudo foi avaliado o tempo de prateleira das membranas de nitrocelulose sensibilizadas com antígeno de P. brasiliensis, armazenadas a -20 o C durante 7, 15, 30, 45, 60 e 90 dias. Vinte e oito amostras de soro foram analisadas em dois grupos de membranas de nitrocelulose (membranas previamente bloqueadas com PBS-leite 5 % e as não-bloqueadas). Não houve diferença no padrão de reatividade quando os soros foram avaliados frente a ambos os grupos, especialmente para membranas armazenadas por 7, 15, 30, 45 e 60 dias. A boa estabilidade do antígeno utilizado para sensibilizar as membranas fez com que estas pudessem ser armazenadas a -20 °C até 60 dias. Estas características contribuem para efetuar o diagnóstico rápido da PCM, bem como as perspectivas dessas membranas sensibilizadas serem encaminhadas para os laboratórios, que não possuam infraestrutura necessária para executar as etapas que antecedem a realização de immunoblotting, como a produção de antígeno, as técnicas de SDS PAGE e Western blot. Este procedimento contribui substancialmente para melhorar o diagnóstico sorológico da PCM, pois poderá fornecer resultados reprodutíveis nas unidades componentes da Rede de Laboratórios.

Referências

Colombo AL, Tobón A, Restrepo A, Queiroz-Telles F, Nucci M. Epidemiology of endemic systemic fungal infections in Latin America. Med Mycol 2011;49(8):785-98. [DOI: http://dx.doi.org/10.3109/1 3693786.2011.577821].

Gonzalez A, Hernandez O. New insights into a complex fungal pathogen: the case of Paracoccidioides spp. Yeast. 2016;33(4):113-28.[DOI: http:/dx.doi.org/10.1002/yea.3147].

De Oliveira HC, Assato PA, Marcos CM, Scorzoni L, de Paula E Silva AC, Da Silva J de F et al. Paracoccidioides-host Interaction: An Overview on Recent Advances in the Paracoccidioidomycosis. Front Microbiol. 2015;25 (6):1319 [DOI: http:dx.doi. org/10.3389/fmicb.2015.01319].

Seyedmousavi S, Guillot J, Tolooe A, Verweij PE, de Hoog GS. Neglected fungal zoonoses: hidden threats to man and animals. Clin Microbiol Infect. 2015;21(5):416-25. [DOI: http:dx.doi.org/10.1016/j.

cmi. 2015.02.031].

Teixeira MM, Theodoro RC, Oliveira FF, Machado GC, Hahn RC, Bagagli E et al. Paracoccidioides lutzii sp. nov.: biological and clinical implications. Med Mycol. 2014; 52(1):19-28. [DOI: http:/dx.doi.org /10.3109/13693786.2013.794311].

Martinez R. Epidemiology of paracoccidioidomycosis. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 2015;57 Suppl 19:11-20. [DOI: http:/dx.doi.org/ 10.1590/S0036-46652015000700004].

Martinez R. Paracoccidioidomycosis: the dimension of the problem of a neglected disease. Rev Soc Bras Med Trop. 2010;43(4):480. [DOI: http:/

dx. doi.org/10.1590/S0037-86822010000400034].

Teles FR, Martins ML. Laboratorial diagnosis of paracoccidioidomycosis and new insights for the future of fungal diagnosis. Talanta. 2011;85(5):2254-64.[DOI: http:/dx.doi.org/10.1016/j.talanta.2011.07.099].

Silva Ferreira C, de Castro Ribeiro EM, Miranda Goes AD, Mello Silva B. Current strategies for diagnosis of paracoccidioidomycosis and prospects of methods based on gold nanoparticles. Future Microbiol. 2016;11:973-85. [DOI: http:/dx.doi.org/10.2217/fmb-2016-0062].

De Camargo ZP. Serology of paracoccidioidomycosis. Mycopathologia. 2008;165:289-302.

da Silva JF, de Oliveira HC, Marcos CM, Assato PA, Fusco-Almeida AM, Mendes-Giannini MJ. Advances and challenges in paracoccidioidomycosis serology caused by Paracoccidioides species complex: an update. Diagn Microbiol Infect Dis. 2016;84(1):87-94.[DOI:http:/dx.doi.org/10.1016/j.diagmicrobio. 2015.06.004].

Fernandes VC, Coutinho JB, Veloso JM, Araújo AS, Pedroso EP, Goes AM. Combined use of Paracoccidioides brasiliensis recombinant rPb27 and rPb40 antigens in an enzyme-linked immunosorbent assay for immunodiagnosis of paracoccidoidomycosis. J Immunol Methods. 2011;367(1-2):78-84. [DOI: http:/dx.doi.org/10.1016/j.jim.2011.02.006].

Silva DF, Assis CM, Zamboni IM, Barreto LC, Kohara VS, Vicentini-Moreira AP. Use of immunoblotting assay improves the sensitivity of paracoccidioidomycosis diagnosis. J Venom Anim Toxins incl Trop Dis. 2008;14(2):313-21.

Perenha-Viana MC, Gonzales IA, Brockelt SR, Machado LN, Svidzinski TI. Serological diagnosis of paracoccidioidomycosis through Western blot technique. Clin Vaccine Immunol. 2012;19:616-9.[DOI: http:/dx.doi.org/10.1128/CVI.05693-11].

Passos AN, Kohara VS, Moreto TC, Mendes RP, Kamikawa CM, Vicentini AP. Analysis of the intrinsic parameters of double immunodiffusion and immunoblotting assays for the paracoccidioidomycosis diagnosis. XI International Meeting on Paracoccidioidomycosis; São Paulo; May 2011 [abstract 45-6].

Passos AN. Avaliação da aplicabilidade da técnica de immunoblotting para a pesquisa de anticorpos circulantes anti-Paracoccidioides brasiliensis e anti-Histoplasma capsulatum em laboratório de Saúde Pública [dissertação de mestrado]. São Paulo (SP): Coordenadoria de Controle de Doenças; 2012.

Silveira-Gomes F, Sarmento DN, Pinto TM, Pimentel RF, Nepomuceno LB, Espirito Santo EP, et al. Development and evaluation of latex agglutination test for the serodiagnosis of paracoccidioidomycosis. Clin Vaccine Immunol. 2011;18(4):604-8. [DOI: http:/dx.doi.org/10.1128/CVI.00130-10].

Kamikawa CM, Vicentini AP. Dot-blot methodology for rapid diagnosis of paracoccidioidomycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis. J Infect Dis Ther. 2015; 3(6). [DOI: http:/dx.doi.org/10.4172/2332-0877.1000256].

Neves AR, Manomi RL, Rossi CL, Camargo ZP, Blotta MH. Negative immunodiffusion test results obtained with sera of paracoccidioidomycosis patients may be related to low-affinity immunoglobulin G2 antibodies directed against carbohydrate epitopes. Clin Diagn Lab Immunol. 2003;10(5):802-7. [DOI: http:/dx.doi.org/ 10.1128/CDLI.10.5.802-807.2003].

Do Valle AC, Costa RL, Fialho Monteiro PC, Von Helder J., Muniz MM., Zancopé-Oliveira RM. Interpretation and clinical correlation of serological tests in paracoccidioidomycosis. Med Mycol. 2001;39:373-7.

Kirkwood TB. Predicting the stability of biological standards and products. Biometrics. 1977;33(4):736-42.

Garcia NM, Assis CM, Del Negro GMB, Aguiar MSMV, Lacaz CS. Análise imunoquímica de antígeno metabólico de P. brasiliensis. Rev Inst Med Trop São Paulo. 1993;35(suppl.10):70.

Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly o the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680-5.

Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA. 1979;76(9):4350-4.